Biotechnol. | 用于活细胞和生物体内的高效邻近标记技术——TurboID Nat-精准医学
来源：王初课题组
大家好，今天和大家分享一篇发表在Natue Biotechnology上的文章，“Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID”，本文的通讯作者是来自斯坦福大学的Alice Y Ting，她致力于发展新的技术进行细胞定位等，并运用这些技术理解线粒体与哺乳动物中脑的信号。
蛋白质相互作用网络和蛋白质区室化是细胞中所有信号传导和调节过程的基础。酶催化邻近标记（PL）已成为研究活细胞中蛋白质的空间和相互作用特征的新方法。然而，目前的PL方法需要超过18小时的标记时间或使用具有有限细胞渗透性或高毒性的化学品。在本篇文章中，作者使用酵母展示定向进化生物素连接酶得到TurboID和miniTurbo的两个混杂突变体，其以比BioID或BioID2更高的催化效率，在细胞中利用无毒且易于递送的生物素仅需10分钟即可完成PL。此外，TurboID将基于生物素的PL扩展到果蝇和线虫。
目前主要有两种酶用于PL，APEX2与BioID。APEX2的优点在于速度快，以及较广的适用范围（也可标记RNA），缺点为需使用H2O2，对活体样品有毒性。BioID的优点是标记简单且无毒，仅需生物素来启动标记，缺点是标记动力学缓慢，且应用范围较窄。新的PL酶，将BioID的简单性和无毒性与APEX2的催化效率相结合，将极大地增强PL应用。为实现这一目标，作者进行了大肠杆菌生物素连接酶（BirA）的定向进化以产生新的混杂突变体，发现BirA-R118S在相同条件下比BioID（BirA-R118G）活性高出两倍，因此作者使用此作为他们的进化起始模板。
首先作者使用酶文库的酵母表面展示与荧光激活细胞分选（FACS）进行了TurboID的定向进化。经易错PCR来诱变BirA-R118S产生107个突变体的文库，与Aga2p交配蛋白融合展示在酵母表面，将生物素和ATP添加到酵母池中以启动混杂的生物素化，使用链霉抗生物素蛋白-荧光团对每个酵母细胞表面上的生物素化位点进行染色，最后FACS富集高度自身生物素化的细胞。作者通过该方法得到两个混杂的连接酶，35 kD TurboID和28kD miniTurbo。
接下来，作者在哺乳动物细胞中对TurboID和miniTurbo进行了表征。在HEK 293T细胞的胞质溶胶中表达TurboID和miniTurbo，添加外源性生物素开始标记，链霉亲和印迹显示TurboID和miniTurbo的内源性生物素化比BioID迅速得多凶兽前锋 。作者也比较了新的混杂连接酶BioID2，TurboID在10分钟内产生的生物素化产物几乎与BioID / BioID2 / BASU在18小时内给出的一样多。同时，作者比较了HEK 293T细胞的细胞核，线粒体基质，ER腔和ER膜中的TurboID，miniTurbo和BioID，以检测不同的细胞器具有不同的pH，氧化还原环境和内源亲核物浓度，这可能影响PL活性。
在全面的蛋白质组学实验中也评估了TurboID和miniTurbo，作者比较了这些连接酶10分钟标记与BioID18小时标记的相似质量的蛋白质组在特异性，覆盖度和标记半径等方面的差异。他们使用线粒体基质，细胞核和ER膜(ERM)进行分析。TurboID和miniTurbo标记各进行10分钟，而BioID标记进行18小时。裂解细胞并富含链霉抗生物素蛋白珠的生物素化蛋白质。在将蛋白质珠粒消化成肽后墙外红杏，用不同同位素的TMT（串联质量标签）标记对肽进行化学标记。这使得能够量化样品中每种蛋白质的相对丰度。在所有三个区室中，TurboID和miniTurbo10分钟衍生的蛋白质组与BioID 18小时衍生的蛋白质组具有相似的大小和特异性。同时作者发现增加标记时间，特异性降低。
最后作者拓展了TurboID和miniTurbo在生物体内的适用范围。他们首先在细菌和酵母中测试了这些连接酶，与哺乳动物细胞一样媚肉之香，TurboID和miniTurbo比BioID活跃得多。同时，作者也在果蝇和线虫中测试了这些连接酶的作用。幼虫翼盘中选择性地表达BioID，TurboID或miniTurbo，在早期胚胎阶段将含有生物素的食物饲养动物5天，用链霉抗生物素蛋白 - 荧光团对切割的翼盘进行染色所示，TurboID-和miniTurbo催化的生物素化分别比BioID催化的生物素化高22倍和10倍。相似的，作者在线虫中也评估了这些连接酶的作用。
总之，作者进行了基于酵母展示的定向进化，结合TSA信号放大，连接酶的还原去除和阴性选择，产生两种新的连接酶：TurboID和miniTurbo。
作者：LSM
文章引用：
doi：10.1038/nbt.4201
文章链接：
https://www.nature.com/articles/nbt.4201
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