Cell丨高璞组揭示新型泛素化修饰的作用机制——胡荣贵、王丰点评-BioArt
编者按：近年来，每当谈起泛素化修饰相关研究，不少业内人士觉得该领域难以再出让人惊艳的工作了，该准备换个方向了。然而2016年华人学者、普渡大学罗招庆团队的研究率先报道了嗜肺军团菌的SidE家族效应蛋白可以不需要E1、E2参与，不依赖ATP而通过水解NAD的形式让一系列蛋白发生泛素化修饰，开创了一个全新的方向，打破了以往的“E1-E2-E3的范式”，从而在泛素领域刮起了一阵新的旋风。然而这种新的泛素化形式的具体分子机制之前并不清楚，然而今日来自中科院生物物理所高璞研究员带领的研究小组在Cell杂志率先报道了这一重要成果。BioArt也邀请到了长期从事泛素相关研究的胡荣贵研究员以及从事过泛素相关结构生物学研究的王丰教授对该工作进行了点评，以飨读者！
责编丨迦溆
点评丨胡荣贵（中科院生化细胞所）
王 丰（北京理工大学）
泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰，可调节真核细胞的多种生命过程，如蛋白降解、细胞内吞、细胞周期以及免疫应答等【1】。经典的泛素修饰系统利用ATP及Mg离子作为辅因子，通过E1（activating）、E2（conjugating）、E3（ligating）的三酶级联反应，最终将ubiquitin的C末端共价连接到底物蛋白的赖氨酸上【1】。在与宿主的长期博弈过程中，病原菌也进化出了多种方式来干预宿主的泛素修饰系统，从而达到增强侵染效率和逃避免疫监视的目的。例如，某些病原菌效应蛋白就具备E3连接酶或去泛素化酶的活性【2】瑜伽拜月式。之前报道的泛素化修饰（不论是宿主自身的，或是病原参与的），均是通过经典的E1-E2-E3三酶级联反应来催化完成的。
2016年，普渡大学罗招庆实验室在Nature上报道了来源于病原菌Legionella pneumophila的，不依赖于E1-E2-E3级联反应的，新型泛素化修饰酶家族：SidE蛋白家族【3】（下图）。随后，Ivan Dikic实验室在Cell上的跟进研究，进一步确认和补充了该新型泛素化修饰的新颖机制【4】。2017年5月，罗招庆实验室又在Cell Research杂志上发表论文（罗招庆组揭示独特的细菌去泛素化酶可逆转磷酸核糖连接的泛素化——胡荣贵点评），揭示了一种由嗜肺军团菌编码的效应蛋白SidJ具有独特的去泛素化酶功能，可逆转由磷酸核糖连接的泛素化。与经典去泛素化酶不同的是，SidJ的活性不依赖于活性的半胱氨酸残基【5】。
SidE家族有四个成员，分别为SidE、SdeA、SdeB及SdeC绝色罗刹，其结构域从N端到C端分别为deubiquitinase（DUB）结构域、phosphodiesterase（PDE）结构域、mono-ADP-ribosyltransferase（mART）结构域、及coil-coil（CC）结构域。Luo和Dikic的上述研究发现，SidE家族的特别之处在于其可通过单个蛋白完成对底物的泛素化修饰，且其修饰的方式也不同于经典系统：首先，mART结构域将NAD分子的ADP-ribose基团连接到ubiquitin第42位的精氨酸上，生成ADP-ribosylated ubiquitin（ADPr-Ub）；然后，PDE结构域进一步切割ADPr-Ub中的磷酸二酯键，生成phospho-ribosylated ubiquitin（Pr-Ub），并同时将Pr-Ub共价连接到底物的丝氨酸上。不过，对于mART结构域如何结合及修饰ubiquitin，以及PDE结构域如何结合及水解ADPr-Ub的具体分子机制仍然不清楚。
2018年5月3日，中科院生物物理研究所高璞课题组同纽约大学Ang Gao合作在Cell杂志在线发表题为“Structural Insights into Non-canonical Ubiquitination Catalyzed by SidE”的研究论文。该工作解析了SidE与ubiquitin和配体的多个复合物的高分辨率晶体结构，并结合大量的生化和突变体分析，较为完整的揭示了这一新型泛素化修饰酶与ubiquitin及其配体的新颖相互作用方式和催化机制。
在这项工作中，研究人员通过大量的尝试，成功获得了SidE多种状态的高分辨率晶体结构，包括：SidE apo状态（催化反应前）、ubiquitin与mART和NAD的结合状态（第一步反应）、以及ubiquitin与PDE和ADP-ribose的结合状态（第二步反应）。SidE的apo结构表明，mART结构域和PDE结构域与之前报道的相关类似结构域相比存在很多新颖的特点。mART和PDE的活性中心相距很远且朝向不同，提示这两个结构域的催化过程是相互独立的。另外，这两个结构域又通过一段保守的基序紧密结合，当丧失这种相互作用时，两个结构域的活性均受到一定程度的影响。
ubiquitin与mART结构域及辅因子NAD的复合物结构显示，mART结构域利用其表面的一个高度保守区域参与结合ubiquitin，而这个互作界面非常靠近mART的催化中心。ubiquitin的C末端tail则贡献了其主要的结合位点，尤其是Arg72位及Arg74紧密结合到mART结构域的表面保守酸性口袋里。NAD的烟酰胺基团则朝向ubiquitin的Arg42和Arg72方向，等待着催化形成ADPr-Ub。虽然从空间距离上来说，Arg42和Arg72都有机会参与反应，但生化结果明确表明只有Arg42是修饰位点，这提示Arg72很可能在催化中起到了一种scaffold的作用，用于稳定Arg42、NAD、及mART之间的互作。
ubiquitin与 PDE结构域及ADP-ribose的复合物结构表明，ubiquitin结合于PDE结构域催化口袋的一侧，其Lys6-Thr9这段区域及His68贡献了主要的结合位点。PDE结构域在结合了ubiquitin后会产生局部的构象变化，以利于催化的进行。比较意外的是，本项研究中报道的PDE与ADP-ribose的结合方式，与之前Dikic实验室利用同源建模方式得到的结合方式完全不同，这也表明真实的结构信息对于准确理解相关分子机制是非常必要的。
对于参与结合及催化的关键氨基酸，研究人员均利用突变体实验进行了酶活验证。结果表明，mART和PDE结构域上的突变（包括ubiquitin结合面和催化中心），都只是影响了各自单独的催化活性，互相之间并没有影响，进一步表明这两个结构域的催化过程是相互独立的。与此同时，SidE与ubiquitin的互作方式也解释了为何ubiquitin C末端的甘氨酸对SidE酶活没有任何影响，以及为何Lys63-, Lys48-, Lys11-, and Met1-连接的 diubiquitin也能够被SidE家族修饰。
与结构信息同样重要的是，研究人员还发现SidE家族蛋白对底物的识别不依赖于底物蛋白的特定三维结构，只要底物蛋白上含有能够进入SidE催化口袋的丝氨酸，那么均可被泛素化修饰。这些结果为开发基于此新型泛素修饰系统的生物学工具提供了基础。
据悉，研究论文的第一作者是生物物理所高璞课题组的助理研究员王勇博士。论文的通讯作者为高璞研究员和纽约大学Ang Gao博士。
专家点评
胡荣贵（中科院生化细胞所研究员，国家“杰青”）
Comments：自上世纪80年代以来，泛素领域已经普遍接受“泛素化修饰必须需要E1、E2和E3甚至E4”的范式。这一范式对类泛素化修饰、仅存于放线菌的原核类泛素化修饰(Pupylation)和细胞自噬ATG8(有学者建议译为始素)脂质化修饰也同样成立。
然而，来自普渡大学罗招庆教授实验室的工作最早发现嗜肺军团菌的SidE家族效应蛋白可以不需要E1、E2参与，不依赖ATP而通过水解NAD即可催化对一系列小Rab蛋白与泛素分子间磷酸根链接的新的泛素化修饰。他们和德国的Ivan Dikic教授组进一步揭示这一新的泛素化修饰通过形成磷酸核糖基化泛素中间体的生化机制。
来自北京生物物理所的高璞和纽约大学的Ang Gao教授和其他几位华人教授都独立解析了这一全新泛素化修饰的结构生物学基础。华人科学家在泛素领域的这一轮新突破的全方位亮眼表现，展现了功能与结构研究领域华人科学家的敏锐眼光和不凡实力。
接下来的问题是宿主里是否本身就存在但是至今未被发现的可以不依赖E1、E2催化泛素化修饰的蛋白？是否有微生物的效应蛋白能够用类似的或者截然不同的方式一站式催化类泛素化修饰和ATG8脂质化修饰？精彩值得期待！
王丰（北京理工大学教授）
Comments：泛素化是真核细胞内重要的翻译后修饰方式，参与了真核细胞多种生理过程的调控。传统的泛素化由E1-E2-E3三级泛素连接酶系统共同合作完成，将泛素分子共价连接在底物蛋白的Lys残基上，进而改变底物蛋白的命运。泛素化是一种可逆过程纪倩儿。和泛素连接酶体系作用相反魔盒与歌声 ，去泛素化酶可以将泛素分子从底物蛋白移走。
由于泛素化过程在免疫系统调控等过程中发挥着重要作用，一些病原微生物为了生存，进化出了真核宿主的E3连接酶或者去泛素化酶的伪装者，胁迫调控宿主相关蛋白的泛素化过程。值得注意的是，无论是来自于宿主细胞还是来自于病原微生物风过舞流云 ，过去所鉴定的泛素化过程永远都需要传统的E1-E2-E3泛素连接酶体系实现。而嗜肺军团菌（Lagionella pneumophila）中SidE effector家族蛋白的发现颠覆了这种传统认知，它催化的底物泛素化过程不依赖于E1-E2，并且泛素化的位点发生在Arg残基而不是经典的Lys残基上。SidE家族蛋白被发现能够催化许多不同底物蛋白进行非经典泛素化，与传统的泛素化调控过程不同的是，常规化的去泛素化酶不能逆转这种非经典化修饰，只有嗜肺军团菌中的 SidJ能够去除这种非经典泛素化。
中国科学院生物物理研究所高璞研究组报道了SidE蛋白apo晶体结构、SidE蛋白/泛素、SidE蛋/NAD以及SidE蛋白/ADP-ribose复合物等晶体结构，捕获到SidE蛋白在结合泛素分子与配体分子前的不同构象。这些结构显示，来自嗜肺军团菌不依赖于传统E1-E2泛素连接酶的、特殊的一体化的泛素化机器SidE蛋白具有许多超出预料的特征，相关生化结果揭示SidE蛋白的底物识别及其所催化的两步反应机理，为阐释这种非经典泛素化机器的分子机制提供了启示哦哈哟 。
参考文献：
1. Husnjak, K. and I. Dikic, Ubiquitin-binding proteins: decoders of ubiquitin-mediated cellular functions. Annu Rev Biochem, 2012. 81: p. 291-322.
2. Ashida, H., M. Kim, and C. Sasakawa, Exploitation of the host ubiquitin system by human bacterial pathogens. Nat Rev Microbiol, 2014. 12(6): p. 399-413.
3. Qiu, J., et al., Ubiquitination independent of E1 and E2 enzymes by bacterial effectors. Nature, 2016. 533(7601): p. 120-4.
4. Bhogaraju, S., et al., Phosphoribosylation of Ubiquitin Promotes Serine Ubiquitination and Impairs Conventional Ubiquitination. Cell, 2016. 167(6): p. 1636-1649 e13.
5、Qiu, J., Yu, K., Fei, X., Liu, Y., Nakayasu,张葳葳 E. S., Piehowski, P. D., ... & Luo, Z. Q. (2017). A unique deubiquitinase that deconjugates phosphoribosyl-linked protein ubiquitination. Cell research, 27(7), 865.
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